Реферат на тему: Исследование клеточного цикла методом проточной цитометрии (Автор: Шут Марина Владимировна, студент)

Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и разлагают на компоненты. Световые сигналы детектируют, преобразуют в электрические импульсы и далее в форму, удобную для компьютерной обработки и хранения информации. Методом проточной цитометрии можно получать самые разные данные: определять содержание в клетке ДНК и РНК, суммарное количество белков и количество специфических белков, узнаваемых моноклональными антителами, исследовать клеточный метаболизм (например, измерять внутриклеточный рН), изучать транспорт ионов кальция и кинетику ферментативных реакций (M.G.Ormerod, 1990). В продаже имеются разные проточные цитометры, и изложить общие принципы их работы сложно. Можно отметить лишь несколько моментов, общих для всех приборов: для анализа необходимы гомогенные суспензии изолированных клеток; клетки или ядра должны иметься в достаточном количестве; для устранения эффектов, связанных с возможной агрегацией клеток, необходимо использовать всю доступную информацию, например данные по рассеянию света в объеме и отношение площади пика к его ширине. 2. Анализ ДНК-гистограмм Измерение содержания ДНК – одно из самых простых и распространенных применений проточной цитометрии. Первые ДНК-гистограммы, полученные в 1969 г.(M.A.Va Dilla, . . rujillo, P.F.Mulla ey, J.R.Coul er, 1969), позволили четко различить клетки, находящиеся в G1-, S- и G2/М-фазах клеточного цикла. С тех пор появилось множество работ по измерению содержания ДНК в клиническом материале, полученном в основном от больных раком. Из ДНК-гистограмм можно получить два рода данных. Во-первых, идентифицировать клетки с аномальным содержанием ДНК (рис.1, Б), так называемые анеуплоидные клетки. Во-вторых, определить долю клеток, находящихся в S-фазе (SPF), и оценить степень пролиферации. Как правило, в клеточной популяции с высокой пролиферативной активностью число клеток в S-фазе больше, чем обычно. Международный комитет по аналитической цитометрии (W.Hoddema , J.Schuma , M.A dreeff, B.Barlogie, C.J.Herma , R.C.Lief e .al, 1984) попытался стандартизировать множество способов анализа ДНК-гистограмм, и тем не менее для анализа продолжают использовать различные подходы, часто с привлечением компьютерных прграмм. Далее будут рассмотрены некоторые из этих подходов : Вычисление коэффициента вариации (CV) Самый простой способ оценки качества результатов основан на вычислении CV для G1-пика ДНК диплоидных клеток. Эта величина определяется из приведенного ниже соотношения в предположении, что G1-пик следует нормальному распределению: CV = W / (M · 2,35), Где W – ширина пика на уровне полувысоты, М – номер канала для максимума G1- пика. Чем меньше CV и чем лучше G1-пик отвечает нормальному распределению, тем качественнее результаты. В действительности качество ДНК-гистограмм, как правило, не очень высоко, и чтобы судить о достоверности результатов, полученных при клинических исследованиях, приходится оценивать средний CV и диапазон его значений. Вычисление индекса ДНК Индекс ДНК для «анеуплоидного» пика (пиков) на гистограммах с двумя или более G1-пиками (рис.1, Б) вычисляют, ориентируясь на «диплоидный» G1-пик. Так, на рис. 1, Б G1-пику для опухолевых клеток соответствует вдвое большее количество ДНК, чем G1-пику диплоидных клеток, поэтому индекс ДНК для него равен 2,0.

Выбор способа дезагрегации зависит от типа ткани, размеров препарата, целей исследования, а иногда от быстроты и стоимости метода. Суспендирование архивных препаратов, залитых в парафин Методика исследования ДНК с помощью проточной цитометрии суспензии ядер, полученной из заключенных в парафин архивных препаратов, была впервые описана в 1983 г. (D.W.Hedley, M.L.Friedla der, I.W. aylor, 1983). Эту методику можно использовать в модифицированном виде для анализа самых разнообразных опухолей. Это дает целый ряд преимуществ: можно проводить обширные ретроспективные клинические исследования; значительно упрощается изучение редко встречающихся патологий; парафиновые срезы легко транспортировать, что позволяет проводить цитометрические исследования в специальных центрах. Недостатки метода состоят в том, что: качество получаемых результатов, как правило, не очень высокое; нельзя использовать внутренний ДНК-стандарт. Качество результатов можно повысить, если немного усовершенствовать фиксацию тканей (C.E.Gille , R.S.Camplejoh , S.M.OґReily, 1990). Хороший эффект дает фиксация в формалине при нейтральном рН при 4єС в течение ночи. Следует избегать нагревания ткани (если только оно не является абсолютно необходимым при ее обработке) или неоправданно длительной фиксации. Окрашивание ДНК При окрашивании клеточной ДНК с целью последующего определения ее содержания с помощью проточной цитометрии следует учитывать: специфичность красителя по отношению к ДНК; его спектральные характеристики: интенсивность флуоресценции и возможность ее регистрации имеющимися в продаже приборами; стоимость и удобство в работе (растворимость, стабильность и т.д.) Этим требованиям отвечает целый ряд флуорохромов. Детальное их описание дано в работах Waggo er A.S. (1990), Crissma H.A., S ei camp J.A. (1990), Laff S.A., La golis R.J. (1990). В проточной цитометрии для окрашивания ДНК чаще других флуорохромов используется иодистый пропидий (ИП) даже несмотря на то, что он не строго специфичен по отношению к ДНК. С помощью ИП можно окрашивать также двухцепочечную РНК. Спектральные характеристики ИП очень удобны для проточной цитометрии: для возбуждения флуоресценции используется обычный аргоновый лазер с рабочей длиной волны 488 нм, а максимум флуоресценции находится вблизи 620 нм, что позволяет параллельно использовать флуоресцеин при проведении многопараметрических измерений. Независимо от красителя последний должен находиться с ДНК в стехиометрических соотношениях, т.е. количество связанного с ДНК красителя должно быть пропорционально содержанию ДНК в клетке. Чтобы красителем были заняты все доступные для связывания места, его следует брать в некотором избытке. Большинство флуоресцирующих красителей, связывающихся с ДНК, в том числе и ИП, не могут проходить через мембраны интактных клеток. Чтобы повысить проницаемость мембран, клетки либо фиксируют спиртом, либо обрабатывают детергентами. Использование другой ДНК в качестве стандарта. Содержание ДНК, которой отвечает один из пиков на ДНК-гистограмме для исследуемого препарата, можно оценить, сравнив этот пик с пиком для другой ДНК, содержание которой известно.

Известно, что изменения, регистрируемые в хромосомах, могут быть определяющими диагностическими маркерами опухоли, особенно на начальных этапах возникновения злокачественного процесса. Однако используемые методы анализа хромосомного материала сравнительно сложны и трудоемки. Поэтому в последнее время наряду с обычными цитогенетическими методами исследования кариотипа нормальных и малигнизированных клеток стали применяться сканирующие и проточные цитометрические анализаторы. Приборы последнего типа обеспечивают достаточно высокую точность и скорость измерения, а также воспроизводимость результатов. Скорость анализа хромосом в протоке составляет 1000 – 2000 хромосом в секунду. Проточный цитометрический анализ ДНК метафазных хромосом в суспензии является совершенно новым методом кариотипирования. Поэтому в исследованиях такого рода основной акцент делается на разработке эффективных методов сепарации интактных хромосом с сохранением их целостности и морфологической структуры. В представленных работах чаще всего изучаемой моделью являются метафазные хромосомы, полученные из клеток китайского хомячка и человека, приготовленные для прямого кариотипирования, а также для анализа кариотипа с кратковременным или длительным культивированием клеток. Для анализа генетического материала используются однопараметрические проточные системы, где проводится анализ и сортировка хромосом по интенсивности флуоресценции в комплексе с такими флуорохромами, как PI, E Br, Ho 33258, а также применяются высокоразрешающие проточные цитометры с двухлазерной системой, которые обеспечивают бивариантный анализ ДНК, меченный двумя флуорохромами. Большей частью используют сочетание Но 33258, специфически связывающийся с АТ-богатыми участками ДНК, и хромомицин А3, селективно взаимодействующий с ГЦ-парами. Данные, полученные при помощи автоматизированных систем, представляются в виде гистограмм, так называемых проточных кариограмм. О качестве анализа свидетельствует высокое разрешение гистограмм, Которые характеризуются множественными узкими пиками, относящимися к различным классам хромосом. Количество пиков в большинстве случаев соответствует набору хромосом, которое характерно для данного индивидуума. При исследовании клеток зародыша китайского хомячка методом проточного кариотипирования на этапе экспоненциального роста были получены все 11 пиков, соответствующие 11 парам хромосом самки, исследуемого животного (J.A.S ei kamp, 1984). Обычно применяемые цитогенетические методы не позволяют идентифицировать Y-хромосому из G- и F-групп хромосом человека. Применение проточной цитометрии позволяет решить эту задачу. Так, на лимфоцитах, выделенных из периферической крови доноров-мужчин, с кратковременным культивированием (52 ч) и добавлентем колцемида была показана возможность определения позиции Y-хромосомы по интенсивности ДНК-флуоресценции (Но 33258) в виде пика на проточной кариограмме. У 17 обследуемых доноров позиция Y-хромосомы на гистограмме варьировала. В некоторых наблюдениях пик Y-хромосомы находился между 19 и 20 хромосомами, в других – между 20-й и 17-й.